Транскриптомные часы старения: у приматов и грызунов найдены универсальные маркеры возраста и риска смерти

Рис. 1. Биологические процессы, связанные со старением: усиление иммунной активности и воспалительных процессов, ослабление функции митохондрий, нарушение регуляции клеточного цикла (сенесцентные клетки), апоптоз, нарушение процессов обновления и ремонта внеклеточного матрикса, химические и структурные изменения хроматина. Всё перечисленное отражается на активности генов, которую благодаря этому можно использовать для оценки биологического возраста организма и риска смерти. Рисунок из популярного синопсиса к обсуждаемой статье в Nature

Понимание молекулярных механизмов старения важно как для теоретической биологии, так и для медицины. Геронтологии нужны надежные «молекулярные часы», способные оценивать не только календарный возраст организма, но и его текущее физиологическое состояние, включая риск смерти. Международный коллектив ученых под руководством Вадима Гладышева построил такие часы по транскриптомам (профилям активности генов) четырех видов млекопитающих. Оказалось, что у мышей, крыс, макак и человека действительно существуют общие молекулярные признаки старения, устойчиво проявляющиеся в разных тканях, а также при разных вмешательствах, ускоряющих или замедляющих старение. Эти признаки связаны с активностью генов, относящихся к нескольким функциональным блокам: иммунный ответ и воспаление, клеточная сенесценция и апоптоз, митохондрии и энергетический обмен, регуляция хроматина и внеклеточного матрикса. Выявленные транскриптомные маркеры позволяют оценивать биологический возраст не только организма в целом, но и отдельных подсистем, благодаря чему стало видно, что разные болезни и вмешательства старят или омолаживают разные модули. Молекулярные признаки старения сходят на нет в раннем эмбриогенезе, а также ослабляются при некоторых экспериментальных вмешательствах, то есть они частично обратимы или по крайней мере регулируемы. При этом остается открытым вопрос, какие транскриптомные изменения являются причинами старения, а какие — следствиями накопленных повреждений, защитными или компенсаторными реакциями. Транскриптомные часы помогут ускорить проверку геропротекторов и понять, какие именно процессы затрагивает то или иное вмешательство. Результаты согласуются с идеей, что в основе старения лежит накопление делетериома (совокупности всевозможных повреждений и сбоев), и не поддерживают гипотезу о генетической программе альтруистического самоуничтожения организма.

1. Зачем нужны «молекулярные часы старения»

Вопрос о приоде старения остается одной из самых острых и бурно обсуждаемых тем в биологии. Он занимает и теоретиков, и практиков, ищущих способы продлить период здоровья и активности человека. Старение представляет собой классическую эволюционную загадку. Ведь этот процесс явно вреден для особи, так почему же естественный отбор сделал нестареющими не все организмы, а лишь немногие, вроде гидры? С другой стороны, медицинская сторона проблемы становится всё более актуальной. Чем успешнее медицина справляется с отдельными причинами смерти, тем яснее видно, что главным препятствием на пути к радикальному продлению здоровой человеческой жизни являются не отдельные болезни, а общее возрастное ухудшение состояния организма.

Для практической медицины важна разработка надежных «молекулярных часов старения», то есть методов, позволяющих по молекулярным данным оценить, насколько хрупким, изношенным и уязвимым является организм (или отдельная ткань или группа клеток), и насколько велик связанный с этим риск смерти. Такие часы важны по нескольким причинам. Во-первых, люди одного паспортного возраста могут сильно различаться по физиологическому возрасту. Во-вторых, для тестирования вмешательств, предположительно способных замедлить старение, нам нужен быстро измеримый показатель. Не ждать же десятилетиями, чтобы узнать, продлило ли лекарство человеческую жизнь. Конечно, такие проверки начинаются с экспериментов на животных, чаще всего на мышах, но даже на мышах эти опыты дороги и длительны. Поэтому важно найти биомаркеры, которые позволяют быстро понять, сдвигается ли организм под действием лекарства или диеты в сторону более «молодого» состояния.

Ранее было предложено несколько вариантов молекулярных часов, прежде всего эпигенетических (см. Epigenetic clock). Самые известные из них основаны на возрастных изменениях метилирования ДНК. Однако у этого подхода есть важное ограничение: связь между метилированием отдельных участков ДНК и реальными физиологическими изменениями организма порой совсем не очевидна. Упрощенно говоря, такие часы позволяют увидеть, что жить животному осталось недолго, но вопрос «а в чем, собственно, дело?» остается за кадром.

Поэтому логично обратиться к другому уровню молекулярной информации — транскриптому, который отражает уровень экспрессии (активности) всех генов в данной ткани (или даже в отдельной клетке) в данный момент. Экспрессия генов ближе к фенотипу: она показывает, какие биохимические процессы и клеточные программы сейчас активны. Правда, у транскриптомных часов тоже есть свои минусы. Экспрессия генов более переменчива, чем метилирование ДНК, и сильнее зависит от ткани, состояния клетки, внешних условий и технических деталей эксперимента. Может быть, поэтому прежние транскриптомные часы уступали эпигенетическим по точности и универсальности.

2. Единые транскриптомные часы старения для грызунов и приматов

Коллектив исследователей из США, России, Швейцарии, Канады, Японии и Германии во главе с известным геронтологом из Гарвардской медицинской школы Вадимом Гладышевым попытался преодолеть это ограничение. Для этого они проанализировали более 11 тысяч транскриптомов из десятков тканей четырех видов млекопитающих: мышей, крыс, макак-крабоедов и людей.

Исследователи начали с массива данных по активности генов у мышей и крыс, включая мышей из американской программы Interventions Testing Program, в рамках которой тестируются разнообразные способы продления и сокращения мышиной жизни. Данные по грызунам включали 4539 образцов (транскриптомов) из 26 тканей и 79 разных экспериментальных обстановок (то есть вмешательств, продляющих или сокращающих жизнь) (рис. 2). Для проверки того, насколько общими являются найденные у грызунов закономерности, были привлечены данные по приматам: 2623 образца из 30 тканей макаки-крабоеда и 4003 человеческих образца из мозга, скелетных мышц, кожи и крови.

Рис. 2. Данные по грызунам, использованные для создания транскриптомных часов старения. Внутренний круг показывает образцы мышей и крыс разного возраста без специальных воздействий на продолжительность жизни. Это данные по естественному старению разных тканей (n = 3575). Внешний круг включает эти же контрольные образцы плюс 964 дополнительные группы, подвергавшиеся разнообразным вмешательствам, влияющим на продолжительность жизни (n = 3575 + 964 = 4539). Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

На основе всех этих транскриптомов авторы попытались найти универсальные (то есть годящиеся для разных видов, тканей и вмешательств) молекулярные маркеры, по которым можно предсказать три разные, хотя и связанные друг с другом величины.

Первая — обычный хронологический возраст организма. Для сравнения разных видов его считали не в годах, а в долях от максимальной продолжительности жизни вида.

Вторая величина — нормализованный возраст. Здесь возраст животного делили не просто на максимум для всего вида, а на максимальную продолжительность жизни именно в данной экспериментальной модели. Например, если какое-то лекарство замедляет старение у мышей, то годовалая мышь на этом лекарстве имеет меньший нормализованный возраст, чем годовалая мышь из контрольной группы.

Третья величина — текущий риск смерти. Его рассчитывали для каждого вида, пола, вмешательства и календарного возраста при помощи модели Гомперца, как описано в новости Панцири и яды способствуют эволюции долголетия у амфибий и рептилий («Элементы», 05.07.2022). По сути, это просто уровень смертности, характерный для животных данного вида в данном эксперименте и в данном календарном возрасте.

Таким образом, ученые искали в транскриптомах указания на то, насколько организм продвинулся по своей ожидаемой жизненной траектории и каковы его шансы умереть в ближайшее время.

Главный результат состоит в том, что стратегия авторов сработала. Им удалось построить транскриптомные часы, которые по уровню активности генов в разных органах и тканях предсказывают обычный возраст, нормализованный возраст и ожидаемый риск смерти у всех четырех видов млекопитающих при широком круге разных воздействий, влияющих на скорость старения.

Это важно не только для практики, но и для теории. Получается, что в старении мышей, крыс, макак и людей есть существенный общий молекулярный компонент. Разумеется, печень, мозг, мышцы и кровь стареют не одинаково, да и мышь — далеко не человек. Но за этими принципиальными различиями всё же просматриваются схожие изменения в работе генов, происходящие в ходе старения. Заранее это не было гарантировано. В принципе могло оказаться, что в старении разных тканей мало общего: у печени свои возрастные проблемы, у мозга свои, у мышц свои. Старение короткоживущих грызунов и долгоживущих приматов могло оказаться настолько разными процессами, что общих транскриптомных признаков не удалось бы найти. Такой результат означал бы, что «старение вообще» — скорее удобная абстракция, чем единый биологический процесс с универсальными молекулярными и физиологическими закономерностями. Но результаты говорят об обратном: при всей тканевой и видовой специфике у млекопитающих существуют общие транскриптомные признаки старения.

Дополнительная проверка показала, что этот общий сигнал виден не только на уровне целых органов и тканей, но и на уровне отдельных типов клеток. Авторы проанализировали транскриптомы мышиных нейронов, фибробластов и других типов клеток (всего 49 типов). Выяснилось, что транскриптомы 48 из этих 49 типов клеток позволяют худо-бедно предсказывать нормализованный возраст организма, а по транскриптомам 46 клеточных типов можно оценить риск смерти. Это значит, что обнаруженный сигнал старения не сводится только к тому, что в старой ткани меняются пропорции разных клеток, например становится больше иммунных клеток или меньше стволовых. Отдельные клетки с возрастом сами переходят в более «старое» молекулярное состояние.

3. Функции генов, формирующих «часы», отражают ключевые аспекты старения

Следующий вопрос, который поставили перед собой исследователи: какие именно гены вносят главный вклад в работу транскриптомных часов? Оказалось, что эти гены подразделяются на несколько хорошо очерченных функциональных групп, каждая из которых имеет очевидную связь с тем, что обычно понимают под физиологическим старением.

Во-первых, это гены воспаления и иммунного ответа. Их активность повышается с возрастом и ростом риска смерти. Это согласуется с представлением о хроническом воспалении как одном из центральных признаков старения.

Другой функциональный блок связан с митохондриями и энергетическим обменом. При старении нарушается работа митохондрий, что влияет на энергетику клетки и ее способность справляться со стрессом.

Третий блок — регуляция хроматина и работы генов, то есть механизмы, которые определяют, какие участки генома в клетке открыты для считывания, а какие молчат. Вышеупомянутые «эпигенетические часы старения» работают как раз с результатами (а отчасти и с причинами) возрастных изменений экспрессии генов этого блока.

Четвертый блок связан с организацией внеклеточного матрикса — сложной молекулярной сети, которая заполняет пространство между клетками. От матрикса зависят прочность и эластичность тканей, заживление повреждений и передача механических и химических сигналов. Он также входит в состав клеточных ниш — локальных микросред, поддерживающих стволовые и другие долгоживущие клетки ткани (см. Stem-cell niche). При старении состав и механические свойства матрикса меняются. Это влияет на сигналы, получаемые клетками от своего окружения, и на поведение самих клеток.

Пятый блок включает гены, связанные с клеточным стрессом и сенесценцией (состоянием, при котором клетка остается живой, но перестает делиться и начинает менять тканевую среду вокруг себя; см. Клеточное старение). Один из важных маркеров сенесценции — белок p21, кодируемый геном CDKN1A. Он тормозит клеточный цикл и помогает остановить деление клетки при повреждении ДНК или других опасных нарушениях. В молодом организме такая реакция обычно полезна: она снижает риск превращения поврежденной клетки в опухолевую. Но с возрастом, когда повреждений и стрессовых сигналов становится больше, повышенная активность p21 ведет к накоплению сенесцентных клеток и ухудшению регенерации тканей. Новые данные показали, что усиленная экспрессия CDKN1A связана с повышенным риском смерти.

Изменения активности генов всех этих функциональных групп — транскриптомные признаки старения. Однако в разных тканях и при разных воздействиях эти изменения происходят в разных пропорциях. Именно здесь у транскриптомных часов есть преимущество перед эпигенетическими: они не только оценивают возраст и риск смерти, но и показывают, какие именно биологические процессы в данной конкретной ситуации сдвигаются в более «молодую» или «старую» сторону.

Например, при хронических болезнях ускоряется в первую очередь «старение» воспалительного модуля. Больные ткани выглядят старше главным образом потому, что в них активируются гены иммунной защиты и воспалительных реакций. Напротив, ограничение калорийности сильнее затрагивает митохондриальные и метаболические модули, то есть гены, связанные с энергетическим обменом.

Таким образом, физиологическое старение — это не абсолютно единый и неделимый процесс, а скорее взаимосвязанная совокупность полуавтономных изменений в разных клеточных подсистемах.

4. Транкриптомные признаки старения частично обратимы

Еще один важный результат состоит в том, что признаки, связанные с повышенным риском смерти, оказались частично обратимыми. Это проверили на нескольких моделях клеточного или организменного омоложения. В частности, выяснилось, что в культуре человеческих фибробластов возрастные изменения транскриптома ослабляются при включении hTERT — каталитического компонента теломеразы (см. Telomerase reverse transcriptase). Такие клетки дольше сохраняют способность к делению и не так быстро входят в сенесцентное состояние.

Транскриптомные признаки старения уменьшаются также при перепрограммировании фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. В результате перепрограммирования специализированная клетка возвращается в более раннее, «эмбрионоподобное» состояние, и при этом стирается часть возрастных молекулярных признаков.

Похожий эффект наблюдается при гетерохронном парабиозе (см. Heterochronic parabiosis) — классическом опыте, в котором молодую и старую мышь хирургически соединяют так, что у них возникает общая система кровообращения. Оказалось, что у старых мышей после такого соединения транскриптом печени сдвигается в более «молодую» сторону, а признаки, связанные с повышенной смертностью, слабеют. Это, конечно, не значит, что из старых тканей исчезают все накопленные повреждения. Но, по-видимому, молодая кровь разбавляет старые провоспалительные факторы, притормаживает работу стрессовых и воспалительных программ и частично возвращает ткань печени к более «молодому» молекулярному состоянию.

Яркий пример транскриптомного омоложения дает раннее эмбриональное развитие. У мышиного эмбриона транскриптомный возраст сначала снижается и достигает минимума примерно на 10-й день после оплодотворения — вскоре после нейруляции, когда нервная трубка уже сформировалась и появляются зачатки конечностей. Затем, по мере дальнейшего развития эмбриона, транскриптомный возраст снова начинает расти. Это согласуется с идеей, что в начале индивидуального развития существует фаза молекулярного «обнуления» возрастных признаков. Подробнее об этой идее Гладышева рассказано в новости Отсчет старения у человека можно вести со второй недели эмбрионального развития («Элементы», 26.11.2020).

Таким образом, молекулярные признаки старости — это не некий неизгладимый след прожитого времени. Часть из них можно ослабить, например перепрограммировав клетку в стволовую. Или понять, как это делается в эмбриогенезе, и попытаться воспроизвести. В общем, тут есть над чем поработать экспериментаторам — борцам со старением.

5. Практическое значение работы

В обсуждаемой статье предлагается не новый способ борьбы со старением, а новый инструмент для поиска таких способов — возможно, более точный, чем прежние подобные инструменты. Транскриптомные часы можно использовать для тестирования лекарств, диет и иных вмешательств, призванных замедлить старение.

Однако интерпретировать результаты такого тестирования нужно осторожно. Найденные транскриптомные признаки старения коррелируют с возрастом и риском смерти, но это не значит, что именно они являются причинами старения. Они с равным успехом могут быть побочными эффектами старения или попытками организма противостоять негативным возрастным изменениям. Например, рост активности генов стресс-ответа, воспаления и клеточной сенесценции может начаться как адаптивная реакция организма на уже накопившиеся повреждения и только потом, при выполнении определенных условий, стать дополнительной причиной ускоренного разрушения тканей. В таком случае, если мы просто возьмем и насильственно вернем эти показатели к молодому уровню, это не обязательно замедлит старение и даже может навредить, ослабив полезную реакцию, направленную на борьбу с вредными возрастными изменениями.

Работа наглядно показала, что исследования старения всё сильнее зависят от больших массивов грамотно собранных данных. Молекулярные часы — это модель, которая учится на тех данных, которые ей дали. Если данных много, они разнообразны и включают разные виды, ткани, возрасты и воздействия, то модель получает шанс уловить действительно общие закономерности. Сила обсуждаемой работы именно в масштабе, поскольку авторы проанализировали тысячи разнородных транскриптомов. Но нужно иметь в виду, что данных о вмешательствах, реально продлевающих жизнь хотя бы мышам, пока накоплено не так уж много, да и эффекты эти обычно не очень сильные. А ведь мыши — животные короткоживущие, и продлить им жизнь относительно легко (возможно, потому, что их предки отбирались на быстрое размножение и короткий жизненный цикл из-за низкой защищенности и очень высокой внешней смертности, см. Панцири и яды способствуют эволюции долголетия у амфибий и рептилий, «Элементы», 05.07.2022).

С человеком ситуация намного хуже. Мы и так долгожители по сравнению с другими обезьянами. Наши предки явно подвергались отбору на долголетие (см. Что общего у голых землекопов и «голых обезьян»?, «Элементы», 06.03.2017). Поэтому неудивительно, что для человека пока вообще нет доказанных и общепризнанных вмешательств, замедляющих старение. Из-за этого отлаживать «транскрипционные часы» на человеческих данных намного труднее. В итоге вполне может оказаться, что часы, представленные в обсуждаемой работе, будут полезны для продления мышиной жизни, но не человеческой.

6. Накопление повреждений или альтруистическое самоубийство?

Результаты исследования хорошо укладываются в представление о старении как о постепенном накоплении делетериома — совокупности разнообразных нарушений, повреждений и сбоев регуляции (см. Deleteriome). Эту идею Гладышев и его коллеги развивают уже давно (см. Экстракт из старых сородичей ускоряет старение, «Элементы», 20.02.2017), и на сегодняшний день она, на мой взгляд, является наиболее обоснованной. Повреждения возникают постоянно и неизбежно, сами собой — для этого не нужно никакой специальной генетической программы. А эволюция быстрого или медленного старения обусловлена тем, насколько силен отбор на совершенствование систем, ответственных за борьбу с этими повреждениями.

Если в основе старения действительно лежит накопление повреждений, то можно ожидать, что его молекулярные признаки будут выглядеть не как работа специальной генетической программы, нарочно делающей организм с течением времени всё более слабым и уязвимым, а скорее как большой и разнообразный набор реакций на всевозможные повреждения и сбои: воспаление, стресс-ответ, сенесценция, активация p21 и так далее. Именно это и увидели авторы. Причем эти признаки усиливаются не только в ходе нормального старения, но и при хронических болезнях, повреждении клеток в культуре, облучении (авторы анализировали мышиные фибробласты, подвергавшиеся гамма-облучению: их транскриптомный возраст от этого увеличивался), а также в генетических моделях ускоренного старения. При перепрограммировании клеток, включении теломеразы, гетерохронном парабиозе и в раннем эмбриогенезе часть этих признаков ослабляются или сходят на нет. Такая картина выглядит естественно, если биологический возраст — это не таймер, отсчитывающий время до самоуничтожения, а состояние системы, зависящее от накопленных повреждений, метаболического стресса и способности организма противостоять наступающему хаосу.

С идеей старения как программы альтруистического самоубийства полученные результаты согласуются плохо. Если бы старение у млекопитающих было результатом работы эволюционно обусловленной программы ликвидации старой особи ради блага ее молодых родичей (как, вероятно, у червячка C. elegans, см. Быстрое старение у нематоды C. elegans поддерживается родственным отбором, «Элементы», 15.01.2019), то мы ожидали бы увидеть в транскриптомных данных хоть какой-то намек на существование специализированного механизма альтруистического самоубийства. Мы ожидали бы увидеть конкретную регуляторную генетическую программу, отключающую защитные системы и запускающую деградацию организма по достижении определенного состояния или возраста. Вместо этого мы видим, по большому счету, лишь признаки множества самых разнообразных повреждений и отчаянные попытки стареющего организма справиться с их неотвратимой волной.

Новые данные плохо согласуются и с вариантом гипотезы, согласно которому старые особи должны погибать, чтобы не заражать молодых накопленными за жизнь хроническими болезнями. В таком случае центральным сигналом должны были бы быть именно инфекции или эпидемиологически опасные состояния, а не столь широкий набор внутриклеточных и тканевых нарушений. В целом стареющий организм в свете новых данных выглядит не как машина, дисциплинированно выполняющая программу самоуничтожения, а скорее как система, всё хуже справляющаяся с нарастающим множеством повреждений и сбоев.

Александр Марков